Das Klonen von Genen ist der Vorgang, Kopien oder Klone eines einzelnen Gens herzustellen. Sobald ein Gen identifiziert ist, können Klone in vielen Bereichen der biomedizinischen und industriellen Forschung verwendet werden. Gentechnik ist der Prozess des Klonierens von Genen in neue Organismen oder Ändern der DNA-Sequenz, um das Proteinprodukt zu verändern. Gentechnik hängt von unserer Fähigkeit ab, die folgenden wesentlichen Verfahren durchzuführen.
01 Polymerase-Kettenreaktion
02 Restriktionsenzyme
Die Entdeckung von Enzymen, die als Restriktionsendonukleasen bekannt sind, war für das Protein-Engineering wesentlich. Diese Enzyme schneiden DNA an spezifischen Stellen basierend auf der Nukleotidsequenz. Hunderte von verschiedenen Restriktionsenzymen , die DNA an einer bestimmten Stelle schneiden können, wurden aus vielen verschiedenen Bakterienstämmen isoliert. Mit einem Restriktionsenzym geschnittene DNA produziert viele kleinere Fragmente unterschiedlicher Größe. Diese können mittels Gelelektrophorese oder Chromatographie getrennt werden.
03 Elektrophorese
DNA aus einer Zellkultur zu reinigen oder sie mit Restriktionsenzymen zu schneiden, wäre nicht von großem Nutzen, wenn wir die DNA nicht visualisieren könnten - das heißt, einen Weg finden, um zu sehen, ob dein Extrakt irgendetwas enthält oder welche Größe dich fragmentiert habe es geschnitten. Ein Weg, dies zu erreichen, ist die Gelelektrophorese. Gele werden für eine Vielzahl von Zwecken verwendet, von der Betrachtung geschnittener DNA bis zum Nachweis von DNA-Inserts und Knockouts.
04 Verbinde zwei DNA-Stücke
In der genetischen Forschung ist es oft notwendig, zwei oder mehr einzelne DNA-Stränge zu verbinden, um einen rekombinanten Strang zu erzeugen, oder einen kreisförmigen Strang zu schließen, der mit Restriktionsenzymen geschnitten wurde. Enzyme, die DNA-Ligasen genannt werden, können kovalente Bindungen zwischen Nukleotidketten erzeugen. Die Enzyme DNA-Polymerase I und Polynukleotidkinase sind auch in diesem Prozess wichtig, um Lücken zu füllen oder die 5'-Enden zu phosphorylieren.
05 Auswahl kleiner selbstreplizierender DNA
Kleine kreisförmige DNA-Stücke, die nicht Teil eines bakteriellen Genoms sind, aber zur Selbstreplikation fähig sind, sind als Plasmide bekannt. Plasmide werden oft als Vektoren verwendet , um Gene zwischen Mikroorganismen zu transportieren. Sobald in der Biotechnologie das Gen von Interesse amplifiziert wurde und sowohl das Gen als auch das Plasmid durch Restriktionsenzyme geschnitten wurden, wurden sie miteinander ligiert, wodurch eine sogenannte rekombinante DNA erzeugt wurde. Virale (Bakteriophagen) DNA kann ebenfalls als ein Vektor verwendet werden, ebenso wie Cosmide, rekombinante Plasmide, die Bakteriophagen-Gene enthalten.
06 Methode zum Verschieben eines Vektors in eine Host-Zelle
Der Prozess des Übertragens von genetischem Material auf einen Vektor, wie ein Plasmid, in neue Wirtszellen wird Transformation genannt. Diese Technik erfordert, dass die Wirtszellen einer Veränderung der Umwelt ausgesetzt sind, die sie für den Vektor "kompetent" oder vorübergehend durchlässig macht. Elektroporation ist eine solche Technik. Je größer das Plasmid ist, desto geringer ist die Effizienz, mit der es von Zellen aufgenommen wird. Größere DNA-Segmente werden leichter unter Verwendung von Bakteriophagen, Retroviren oder anderen viralen Vektoren oder Cosmiden in einer Transduktions-Methode kloniert. Phagen oder virale Vektoren werden oft in der regenerativen Medizin verwendet , können aber die Insertion von DNA in Teile unserer Chromosomen verursachen, wo wir es nicht wollen, was Komplikationen und sogar Krebs verursacht.
07 Methoden zur Auswahl transgener Organismen
Nicht alle Zellen nehmen während der Transformation DNA auf. Es ist wichtig, dass es eine Methode gibt, diejenigen zu erkennen, die das tun. Im Allgemeinen tragen Plasmide Gene für Antibiotikaresistenz, und transgene Zellen können basierend auf der Expression dieser Gene und ihrer Fähigkeit, auf Medien zu wachsen, die dieses Antibiotikum enthalten, selektiert werden. Alternative Selektionsmethoden hängen von der Anwesenheit anderer Reporterproteine ab, wie dem x-gal / lacZ- System oder dem grünen Fluoreszenzprotein, die eine Selektion basierend auf Farbe bzw. Fluoreszenz erlauben.