Der PCR-Prozess wurde 1983 entwickelt und ermöglichte die DNA-Sequenzierung und die Identifizierung der Reihenfolge der Nukleotide in einzelnen Genen.
Das Verfahren verwendet einen thermischen Zyklus oder das wiederholte Erhitzen und Abkühlen der Reaktion auf das Schmelzen und Replizieren der DNA. Während der PCR wird die "neue" DNA als Matrize für die Replikation verwendet und es folgt eine Kettenreaktion, die das DNA-Template exponentiell amplifiziert.
PCR-Techniken werden in vielen Bereichen der Biotechnologie einschließlich Protein Engineering , Klonen, Forensik (DNA-Fingerprinting), Vaterschaftstests, der Diagnose von erblichen und / oder Infektionskrankheiten und für die Analyse von Umweltproben angewendet.
Insbesondere in der Forensik ist die PCR besonders nützlich, da sie selbst kleinste DNA-Beweise verstärkt. PCR kann auch verwendet werden, um DNA zu analysieren, die Tausende von Jahren alt ist, und diese Techniken wurden verwendet, um alles von einem 800.000 Jahre alten Mammut zu Mumien aus der ganzen Welt zu identifizieren.
PCR-Verfahren ist wie folgt:
- Initialisierung: Dieser Schritt ist nur für DNA-Polymerasen notwendig, die eine Heißstart-PCR benötigen. Die Reaktion wird auf zwischen 94 und 96 ° C erhitzt und 1-9 Minuten gehalten.
- Denaturierung: Wenn die Prozedur keine Initialisierung benötigt, ist die Denaturierung der erste Schritt. Die Reaktion wird für 20 bis 30 Sekunden auf 94 bis 98 ° C erhitzt. Die Wasserstoffbrücken der DNA-Matrize werden aufgebrochen, und einzelsträngige DNA-Moleküle werden erzeugt.
- Glühen: Die Reaktionstemperatur liegt zwischen 50 und 65 ° C und wird 20 bis 40 Sekunden gehalten. Die Primer lagern sich an die einzelsträngige DNA-Matrize an. Die Temperatur ist während dieses Schrittes extrem wichtig. Wenn es zu heiß ist, kann die Grundierung nicht binden. Wenn es zu kalt ist, kann die Grundierung unvollständig binden. Eine gute Bindung wird gebildet, wenn die Primersequenz eng mit der Matrizensequenz übereinstimmt.
- Verlängerung / Verlängerung: Die Temperatur während dieses Schrittes variiert in Abhängigkeit von der Art der Polymerase. Die DNA-Polymerase synthetisiert einen völlig neuen DNA-Strang.
- Endverlängerung: Dieser Schritt wird 5-70 Minuten nach dem letzten PCR-Zyklus bei 70-74 ° C durchgeführt.
- Letzter Halt: Dieser Schritt ist optional. Die Temperatur wird bei 4-15 ° C gehalten und die Reaktion entfällt.
Das Verfahren gliedert sich in drei Phasen:
- Exponentielle Amplifikation: Während jedes Zyklus wird das Produkt (das spezifische DNA-Stück, das repliziert wird) verdoppelt.
- Leveling-off-Stufe: Wenn die DNA-Polymerase Aktivität verliert und Reagenzien verbraucht, verlangsamt sich die Reaktion.
- Plateau: Es sammelt sich kein Produkt mehr an.