Wie diese Endonukleasen herausstechen
Wie viel wissen Sie über Restriktionsenzyme? Verschaffen Sie sich mit dieser Rezension ein besseres Verständnis darüber, was sie tun und warum sie wichtig sind.
Restriktionsenzyme definieren
Restriktionsendonukleasen sind eine Klasse von Enzymen , die DNA-Moleküle schneiden. Jedes Enzym erkennt eine einzigartige Sequenz von Nukleotiden im DNA-Strang. Solche Sequenzen sind üblicherweise etwa 4 bis 6 Basenpaare lang. Die Sequenzen sind insofern palindrom, als der komplementäre DNA-Strang nur in umgekehrter Richtung die gleiche Sequenz aufweist.
Mit anderen Worten, beide DNA-Stränge werden an derselben Stelle geschnitten.
Wo diese Enzyme gefunden werden
Restriktionsenzyme werden in vielen verschiedenen Bakterienstämmen gefunden, wo ihre biologische Rolle darin besteht, an der Zellabwehr teilzunehmen. Diese Enzyme "beschränken" fremde (zB virale) DNA, die in die Zelle gelangt, indem sie diese zerstören. Die Wirtszelle weist ein Restriktionsmodifikationssystem auf, das seine eigene DNA an für ihre jeweiligen Restriktionsenzyme spezifischen Stellen methyliert und dadurch vor Spaltung schützt. Mehr als 800 bekannte Enzyme wurden entdeckt, die mehr als 100 verschiedene Nukleotidsequenzen erkennen.
Verwendung in der Biotechnologie
Restriktionsenzyme werden in der Biotechnologie verwendet, um DNA in kleinere Stränge zu schneiden, um Fragmentlängenunterschiede zwischen Individuen zu untersuchen (Restriktionsfragmentlängenpolymorphismus - RFLP). Sie werden auch für das Klonen von Genen verwendet.
RFLP-Techniken wurden verwendet, um zu bestimmen, dass Individuen oder Gruppen von Individuen unterschiedliche Unterschiede in Gensequenzen und Restriktionsspaltungsmustern in bestimmten Bereichen des Genoms aufweisen.
Die Kenntnis dieser einzigartigen Bereiche ist die Grundlage für den DNA-Fingerabdruck . Jedes dieser Verfahren hängt von der Verwendung einer Agarosegelelektrophorese zur Trennung der DNA-Fragmente ab. TBE-Puffer, der aus Tris-Base, Borsäure und EDTA besteht, wird üblicherweise zur Agarose- Gelelektrophorese zur Untersuchung von DNA-Produkten verwendet.
Arten von Restriktionsenzymen
Es gibt drei verschiedene Arten von Restriktionsenzymen. Typ I schneidet DNA an zufälligen Orten bis zu 1000 oder mehr Basenpaaren von der Erkennungsstelle. Typ III schneidet bei ungefähr 25 Basenpaaren von der Stelle. Die Typen I und III erfordern ATP und können große Enzyme mit mehreren Untereinheiten sein. Enzyme vom Typ II, die vorwiegend in der Biotechnologie verwendet werden, schneiden DNA ohne ATP in der erkannten Sequenz und sind kleiner und einfacher.
Restriktionsenzyme vom Typ II werden nach der Bakterienart benannt, aus der sie isoliert werden. Zum Beispiel wurde das Enzym EcoRI aus E. coli isoliert. Die meisten Menschen sind mit E. coli- Ausbrüchen in Lebensmitteln vertraut.
Restriktionsenzyme vom Typ II können zwei verschiedene Arten von Schnitten erzeugen, abhängig davon, ob sie beide Stränge in der Mitte der Erkennungssequenz oder jeden Strang näher an einem Ende der Erkennungssequenz schneiden.
Der erstgenannte Schnitt wird "stumpfe Enden" ohne Nukleotidüberhänge erzeugen. Letzteres erzeugt "klebrige" oder "kohäsive" Enden, da jedes resultierende DNA-Fragment einen Überhang aufweist, der die anderen Fragmente ergänzt. Beide sind nützlich in der Molekulargenetik zur Herstellung von rekombinanter DNA und Proteinen.
Diese Form der DNA sticht hervor, weil sie durch die Ligation (Zusammenkleben) von zwei oder mehr verschiedenen Strängen erzeugt wird, die ursprünglich nicht miteinander verbunden waren.