Was PCR mit DNA-Sequenzierung und Amplifikation von Genen zu tun hat
Die Polymerasekettenreaktion ( PCR ) ist eine molekulargenetische Technik zur Herstellung mehrerer Kopien eines Gens und ist auch Teil des Gensequenzierungsprozesses.
Wie funktioniert die Polymerase-Kettenreaktion?
Genkopien werden unter Verwendung einer DNA-Probe hergestellt, und die Technologie ist gut genug, um aus einer einzigen Kopie des Gens, das in der Probe gefunden wurde, mehrere Kopien herzustellen. Die PCR-Amplifikation eines Gens zur Herstellung von Millionen von Kopien ermöglicht den Nachweis und die Identifizierung von Gensequenzen unter Verwendung visueller Techniken basierend auf Größe und Ladung (+ oder -) des DNA-Stücks.
Unter kontrollierten Bedingungen werden kleine DNA-Abschnitte von Enzymen erzeugt, die als DNA-Polymerasen bekannt sind, die komplementäre Desoxynukleotide (dNTPs) zu einem DNA-Stück hinzufügen, das als "Matrize" bekannt ist. Noch kleinere DNA-Stücke, die "Primer" genannt werden, dienen als Ausgangspunkt für die Polymerase. Primer sind kleine künstliche DNA-Stücke (Oligomere), gewöhnlich zwischen 15 und 30 Nukleotiden lang. Sie werden hergestellt, indem kurze DNA-Sequenzen an den Enden des Gens, das amplifiziert wird, erkannt oder erraten werden. Während der PCR wird die DNA, die sequenziert wird, erhitzt und die Doppelstränge werden getrennt. Beim Abkühlen binden die Primer an das Templat (genannt Annealing) und schaffen einen Platz für die Polymerase, um zu beginnen.
Die PCR-Technik
Die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) wurde durch die Entdeckung von thermophilen und thermophilen Polymerase-Enzymen ermöglicht (Enzyme, die strukturelle Integrität und Funktionalität nach Erhitzen auf hohe Temperaturen beibehalten).
Die Schritte in der PCR-Technik sind wie folgt:
- Es wird eine Mischung mit optimierten Konzentrationen von DNA-Matrize, Polymerase-Enzym, Primern und dNTPs erzeugt. Die Fähigkeit, das Gemisch zu erhitzen, ohne das Enzym zu denaturieren, ermöglicht die Denaturierung der Doppelhelix der DNA-Probe bei Temperaturen im Bereich von 94 Grad Celsius.
- Nach der Denaturierung wird die Probe auf einen moderateren Bereich von etwa 54 Grad abgekühlt, was das Annealing (Bindung) der Primer an die einzelsträngigen DNA-Matrizen erleichtert.
- Im dritten Schritt des Zyklus wird die Probe erneut auf 72 Grad erwärmt, die ideale Temperatur für die Taq-DNA-Polymerase für die Verlängerung. Während der Elongation verwendet DNA-Polymerase den ursprünglichen DNA-Einzelstrang als Matrize, um komplementäre dNTPs zu den 3'-Enden jedes Primers hinzuzufügen und einen Abschnitt doppelsträngiger DNA in der Region des Gens von Interesse zu erzeugen.
- Primer, die an DNA-Sequenzen angelagert wurden, die keine exakte Übereinstimmung aufweisen, bleiben nicht bei 72 Grad annealt, wodurch die Verlängerung auf das interessierende Gen beschränkt wird.
Dieser Prozess der Denaturierung, Annealing und Verlängerung wird mehrfach (30-40) wiederholt, wodurch die Anzahl der Kopien des gewünschten Gens in der Mischung exponentiell ansteigt. Obwohl dieser Prozess ziemlich mühsam wäre, wenn er manuell durchgeführt wird, können Proben in einem programmierbaren Thermocycler hergestellt und inkubiert werden, der in den meisten molekularen Laboratorien heute üblich ist, und eine vollständige PCR-Reaktion kann in 3-4 Stunden durchgeführt werden.
Jeder Denaturierungsschritt stoppt den Elongationsprozess des vorherigen Zyklus, wodurch der neue DNA-Strang abgeschnitten und auf ungefähr die Größe des gewünschten Gens gehalten wird.
Die Dauer des Elongationszyklus kann abhängig von der Größe des interessierenden Gens länger oder kürzer gemacht werden, aber schließlich wird die Mehrzahl der Matrizen durch wiederholte PCR-Zyklen auf die Größe des interessierenden Gens allein beschränkt wird aus Produkten beider Primer erzeugt.
Es gibt mehrere verschiedene Faktoren für eine erfolgreiche PCR , die manipuliert werden können, um die Ergebnisse zu verbessern. Die am häufigsten verwendete Methode zum Testen auf das Vorhandensein von PCR-Produkten ist die Agarosegelelektrophorese . Welches verwendet wird, um DNA-Fragmente basierend auf Größe und Ladung zu trennen. Die Fragmente werden dann unter Verwendung von Farbstoffen oder Radioisotopen sichtbar gemacht.
Die Evolution
Seit der Entdeckung der PCR wurden andere DNA-Polymerasen als die ursprüngliche Taq entdeckt. Einige von diesen haben eine bessere "Korrekturlese" -Fähigkeit oder sind bei höheren Temperaturen stabiler, wodurch die Spezifität der PCR verbessert wird und Fehler durch das Einfügen des inkorrekten dNTPs verringert werden.
Einige PCR-Varianten wurden für spezifische Anwendungen entwickelt und werden nun regelmäßig in molekulargenetischen Labors verwendet. Einige davon sind Real-Time-PCR und Reverse-Transcriptase-PCR. Die Entdeckung der PCR hat auch zur Entwicklung von DNA-Sequenzierung, DNA-Fingerprinting und anderen molekularen Techniken geführt.