DNA-Sequenzierungsverfahren

Das Feld der Biotechnologie ist eine ständige Veränderung. Das schnelle Wachstum und die Entwicklung von Spitzenforschung sind abhängig von der Innovation und Kreativität der Wissenschaftler und ihrer Fähigkeit, das Potenzial in einer grundlegenden molekularen Technik zu erkennen und auf neue Prozesse anzuwenden. Das Aufkommen der PCR öffnete viele Türen in der genetischen Forschung, einschließlich einer Möglichkeit der DNA-Analyse und Identifizierung verschiedener Gene auf der Grundlage ihrer DNA-Sequenzen.

Die DNA-Sequenzierung hängt auch von unserer Fähigkeit ab, Gelelektrophorese zu verwenden, um DNA-Stränge zu trennen, die sich in der Größe um so wenig wie ein Basenpaar unterscheiden.

DNA-Sequenzierung

In den späten 1970er Jahren wurden zwei DNA-Sequenzierungstechniken für längere DNA-Moleküle erfunden. Dies waren die Sanger (oder Didesoxy) -Methode und die Maxam-Gilbert- Methode (chemische Spaltung). Die Maxam-Gilbert-Methode basiert auf einer nucleotidspezifischen Spaltung durch Chemikalien und wird am besten zur Sequenzierung von Oligonucleotiden (kurzen Nucleotidpolymeren, gewöhnlich kleiner als 50 Basenpaare) verwendet. Die Sanger-Methode wird häufiger verwendet, da sie sich als technisch einfacher anzuwenden erwiesen hat und mit dem Aufkommen der PCR und Automatisierung der Technik leicht auf lange DNA-Stränge einschließlich einiger ganzer Gene angewendet werden kann. Diese Technik basiert auf dem Kettenabbruch durch Didesoxynukleotide während PCR-Verlängerungsreaktionen.

Sanger-Methode

Bei der Sanger-Methode wird der zu analysierende DNA-Strang als Matrize verwendet und DNA-Polymerase wird in einer PCR-Reaktion verwendet, um komplementäre Stränge unter Verwendung von Primern zu erzeugen.

Vier verschiedene PCR-Reaktionsgemische werden hergestellt, die jeweils einen bestimmten Prozentsatz an Dideoxynukleosidtriphosphat- (ddNTP) -Analoga zu einem der vier Nukleotide (ATP, CTP, GTP oder TTP) enthalten. Die Synthese des neuen DNA-Stranges setzt sich fort, bis eines dieser Analoga eingebaut ist, zu welcher Zeit der Strang vorzeitig verkürzt wird.

Jede PCR-Reaktion wird am Ende eine Mischung von DNA-Strängen unterschiedlicher Länge enthalten, die alle mit dem Nukleotid enden, das für diese Reaktion Didesoxy-markiert wurde. Gelelektrophorese wird dann verwendet, um die Stränge der vier Reaktionen in vier getrennten Bahnen zu trennen und die Sequenz der ursprünglichen Matrize zu bestimmen, basierend darauf, welche Längen von Strängen mit welchem ​​Nukleotid enden.

In der automatisierten Sanger-Reaktion werden Primer verwendet, die mit vier verschiedenfarbigen fluoreszierenden Tags markiert sind. PCR-Reaktionen werden in Gegenwart der verschiedenen Dideoxynukleotide wie oben beschrieben durchgeführt. Als nächstes werden die vier Reaktionsgemische dann kombiniert und auf eine einzelne Spur eines Gels aufgetragen. Die Farbe jedes Fragments wird unter Verwendung eines Laserstrahls detektiert und die Information wird durch einen Computer gesammelt, der Chromatogramme erzeugt, die Peaks für jede Farbe zeigen, aus denen die Matrizen-DNA-Sequenz bestimmt werden kann.

Typischerweise ist das automatisierte Sequenzierungsverfahren nur für Sequenzen bis zu einem Maximum von etwa 700-800 Basenpaaren genau. Es ist jedoch möglich, vollständige Sequenzen von größeren Genen und tatsächlich ganze Genome zu erhalten, wobei schrittweise Verfahren wie Primer Walking und Shotgun-Sequenzierung verwendet werden.

In Primer Walking wird ein praktikabler Teil eines größeren Gens mit der Sanger-Methode sequenziert. Neue Primer werden aus einem zuverlässigen Segment der Sequenz erzeugt und dazu verwendet, den Teil des Gens weiter zu sequenzieren, der außerhalb der Reichweite der ursprünglichen Reaktionen lag.

Shotgun-Sequenzierung umfasst das zufällige Ausschneiden des interessierenden DNA-Segments in geeignetere (handhabbare) große Fragmente, das Sequenzieren jedes Fragments und das Anordnen der Stücke basierend auf überlappenden Sequenzen. Diese Technik wurde durch die Anwendung von Computersoftware zum Anordnen der überlappenden Teile vereinfacht.