Der erforderliche Proteinreinheitsgrad hängt von der beabsichtigten Endverwendung des Proteins ab.
Für einige Anwendungen ist ein Rohextrakt ausreichend. Für andere Anwendungen, wie in Lebensmitteln und Pharmazeutika, ist jedoch ein hoher Reinheitsgrad erforderlich. Um dies zu erreichen, werden typischerweise mehrere Proteinreinigungsverfahren in einer Reihe von Reinigungsschritten verwendet.
Jeder Proteinreinigungsschritt führt normalerweise zu einem gewissen Grad an Produktverlust. Daher ist eine ideale Proteinreinigungsstrategie diejenige, bei der die höchste Reinigungsstufe in den wenigsten Schritten erreicht wird. Die Auswahl der zu verwendenden Schritte hängt von der Größe, Ladung, Löslichkeit und anderen Eigenschaften des Zielproteins ab. Die folgenden Techniken sind am besten für die Reinigung eines einzelnen zytosolischen Proteins geeignet. Die Reinigung von zytosolischen Proteinkomplexen ist komplizierter und erfordert normalerweise die Anwendung verschiedener Methoden.
Erste Schritte zur Proteinaufreinigung
Der erste Schritt zur Reinigung von intrazellulären (innerhalb der Zelle) Proteinen ist die Herstellung eines Rohextraktes .
Der Extrakt enthält eine komplexe Mischung aller Proteine aus dem Zellzytoplasma und einige zusätzliche Makromoleküle, Cofaktoren und Nährstoffe. Der Rohextrakt kann für einige Anwendungen in der Biotechnologie verwendet werden, wenn jedoch die Reinheit ein Problem darstellt, müssen nachfolgende Reinigungsschritte befolgt werden.
Rohproteinextrakte werden durch Entfernung von durch Zelllyse erzeugten Zelltrümmern hergestellt, was unter Verwendung von Chemikalien und Enzymen , Beschallung oder einer French Press erreicht wird. Die Trümmer werden durch Zentrifugation entfernt, und der Überstand wird gewonnen. Rohpräparate von extrazellulären Proteinen können durch einfaches Entfernen der Zellen durch Zentrifugation erhalten werden.
Für bestimmte biotechnologische Anwendungen besteht ein Bedarf an thermostabilen Enzymen : Enzyme, die hohe Temperaturen ohne Denaturierung tolerieren können und dabei eine hohe spezifische Aktivität beibehalten. Organismen, die sie produzieren, werden manchmal als Extremophile bezeichnet. Ein einfacher Weg zur Reinigung eines hitzebeständigen Proteins besteht darin, die anderen Proteine in der Mischung durch Erhitzen zu desaturieren, dann die Lösung abzukühlen (wodurch das thermostabile Enzym gegebenenfalls reformiert oder wieder aufgelöst wird). Die denaturierten Proteine können dann durch Zentrifugation entfernt werden.
Zwischenreinigungsschritte
In der Vergangenheit war ein üblicher zweiter Schritt zur Reinigung eines Proteins aus einem Rohextrakt die Ausfällung in einer Lösung mit hoher osmotischer Stärke (dh Salzlösungen). Nukleinsäuren in dem Rohextrakt können durch Ausfällen von Aggregaten, die mit Streptomycinsulfat oder Protaminsulfat gebildet wurden, entfernt werden.
Die Proteinfällung wird üblicherweise unter Verwendung von Ammoniumsulfat als Salz durchgeführt.
Verschiedene Proteine werden in verschiedenen Konzentrationen von Ammoniumsulfat ausfallen. Im allgemeinen fallen Proteine mit höherem Molekulargewicht in geringeren Konzentrationen von Ammoniumsulfat aus. Salzausfällung führt normalerweise nicht zu einem hochgereinigten Protein, kann aber dazu beitragen, einige unerwünschte Proteine in einer Mischung zu eliminieren und die Probe zu konzentrieren. Salze in der Lösung werden dann durch Dialyse durch poröse Celluloseschläuche, Filtration oder Gelausschlusschromatographie entfernt.
Moderne Biotech-Protokolle nutzen häufig die vielen im Handel erhältlichen Kits, die fertige Lösungen für Standardverfahren bereitstellen. Die Proteinreinigung wird oft unter Verwendung von Filtern und vorbereiteten Gelfiltrationssäulen durchgeführt. Alles, was Sie tun müssen, ist, den Anweisungen zu folgen und das richtige Volumen der richtigen Lösung hinzuzufügen und die spezifizierte Zeitdauer zu warten, während das Eluat (was am anderen Ende der Säule herauskommt) in einem frischen Reagenzglas gesammelt wird.
- Chromatographische Methoden können unter Verwendung von Labor-Säulen oder automatisierten HPLC-Geräten angewendet werden. Die Trennung mittels HPLC kann durch Umkehrphasen-, Ionenaustausch- oder Größenausschlussverfahren erfolgen, und Proben können durch Diodenarray oder Lasertechnologie nachgewiesen werden. In der Tat
Proteinvisualisierung und Beurteilung der Reinigung
- Die Reverse-Phase-Chromatographie (RPC) trennt Proteine aufgrund ihrer relativen Hydrophobie . Diese Technik ist sehr selektiv, erfordert jedoch die Verwendung von organischen Lösungsmitteln. Einige Proteine werden permanent durch Lösungsmittel denaturiert und verlieren ihre Funktionalität während der RPC. Daher wird diese Methode nicht für alle Anwendungen empfohlen, insbesondere wenn es für das Zielprotein erforderlich ist, seine Aktivität beizubehalten.
- Ionenaustauschchromatographie bezieht sich auf die Trennung von Proteinen basierend auf Ladung . Säulen können entweder für Anionenaustausch oder Kationenaustausch vorbereitet werden. Anionenaustauschsäulen enthalten eine stationäre Phase mit einer positiven Ladung, die negativ geladene Proteine anzieht. Kationenaustauschsäulen sind die umgekehrten, negativ geladenen Kügelchen, die positiv geladene Proteine anziehen. Die Elution des Zielproteins (der Zielproteine) erfolgt durch Änderung des pH-Werts in der Säule, was zu einer Änderung oder Neutralisierung der geladenen funktionellen Gruppen jedes Proteins führt.
- Größenausschlusschromatographie ( Gelfiltration ) trennt größere Proteine von kleinen, da die größeren Moleküle schneller durch das vernetzte Polymer in der Chromatographiesäule wandern. Die großen Proteine passen nicht in die Poren des Polymers, während kleinere Proteine dies tun und länger benötigen, um durch die Chromatographiesäule über ihren weniger direkten Weg zu wandern. Eluat wird in einer Reihe von Röhrchen gesammelt, die Proteine basierend auf der Elutionszeit trennen. Die Gelfiltration ist ein nützliches Werkzeug zum Konzentrieren einer Proteinprobe, da das Zielprotein in einem kleineren Elutionsvolumen gesammelt wird, als ursprünglich zu der Säule zugegeben wurde. Ähnliche Filtrationstechniken könnten wegen ihrer Kosteneffektivität bei der Produktion von Proteinen im großen Maßstab verwendet werden.
- Affinitätschromatographie ist eine sehr nützliche Technik zum "Polieren" oder Vervollständigen des Proteinreinigungsverfahrens. Die Kügelchen in der Chromatographiesäule sind mit Liganden verknüpft, die spezifisch an das Zielprotein binden. Das Protein wird dann durch Spülen mit einer Lösung, die freie Liganden enthält, von der Säule entfernt. Diese Methode liefert im Vergleich zu anderen Techniken die reinsten Ergebnisse und die höchste spezifische Aktivität.
- SDS-PAGE ist Polyacrylamid-Gelelektrophorese, die in Gegenwart von SDS (Natriumdodecylsulfat) durchgeführt wird, das an Proteine bindet, was ihnen eine große negative Nettoladung verleiht. Da die Ladungen aller Proteine ziemlich gleich sind, trennt diese Methode sie fast ausschließlich nach Größe. SDS-PAGE wird häufig verwendet, um die Reinheit von Protein nach jedem Schritt in einer Reihe zu testen. Wenn unerwünschte Proteine allmählich aus dem Gemisch entfernt werden, wird die Anzahl der auf dem SDS-PAGE-Gel sichtbar gemachten Banden reduziert, bis nur noch eine Bande das gewünschte Protein darstellt.
- Immunoblotting ist eine Proteinvisualisierungstechnik, die in Kombination mit Affinitätschromatographie angewendet wird. Antikörper für ein spezifisches Protein werden als Liganden auf einer Affinitätschromatographiesäule verwendet. Das Zielprotein wird auf der Säule zurückgehalten und dann durch Spülen der Säule mit einer Salzlösung oder anderen Mitteln entfernt. Antikörper, die mit radioaktiven oder Farbstoffmarkierungen verbunden sind, helfen beim Nachweis des Zielproteins, sobald es von dem Rest der Mischung getrennt ist.
Quellen:
Zubay G. 1988. Biochemie, 2. Auflage. Macmillan Publishing Co., New York, NY, USA.
Amersham Pharmacia Biotech. 1999. Protein Purification Handbook, Ausgabe AB. Amersham Pharmacia Biotech Inc. New Jersey, USA. http://www.biochem.uiowa.edu/donelson/Database%20items/protein_purification_handbook.pdf.