Methoden zur Proteinaufreinigung

Ein wichtiger Teil der biotechnologischen Forschung ist die Verwendung von Protein-Engineering-Techniken , um Proteine ​​mit optimierten Eigenschaften für spezifische industrielle Anwendungen zu entwickeln oder zu modifizieren. Um dies zu tun, müssen Wissenschaftler in der Lage sein, Proteine ​​von Interesse zu isolieren und zu reinigen, so dass ihre Konformationen, Substratspezifitäten, Reaktionen mit anderen Liganden und spezifische Aktivitäten untersucht werden können.

Der erforderliche Proteinreinheitsgrad hängt von der beabsichtigten Endverwendung des Proteins ab.

Für einige Anwendungen ist ein Rohextrakt ausreichend. Für andere Anwendungen, wie in Lebensmitteln und Pharmazeutika, ist jedoch ein hoher Reinheitsgrad erforderlich. Um dies zu erreichen, werden typischerweise mehrere Proteinreinigungsverfahren in einer Reihe von Reinigungsschritten verwendet.

Jeder Proteinreinigungsschritt führt normalerweise zu einem gewissen Grad an Produktverlust. Daher ist eine ideale Proteinreinigungsstrategie diejenige, bei der die höchste Reinigungsstufe in den wenigsten Schritten erreicht wird. Die Auswahl der zu verwendenden Schritte hängt von der Größe, Ladung, Löslichkeit und anderen Eigenschaften des Zielproteins ab. Die folgenden Techniken sind am besten für die Reinigung eines einzelnen zytosolischen Proteins geeignet. Die Reinigung von zytosolischen Proteinkomplexen ist komplizierter und erfordert normalerweise die Anwendung verschiedener Methoden.

Erste Schritte zur Proteinaufreinigung

Der erste Schritt zur Reinigung von intrazellulären (innerhalb der Zelle) Proteinen ist die Herstellung eines Rohextraktes .

Der Extrakt enthält eine komplexe Mischung aller Proteine ​​aus dem Zellzytoplasma und einige zusätzliche Makromoleküle, Cofaktoren und Nährstoffe. Der Rohextrakt kann für einige Anwendungen in der Biotechnologie verwendet werden, wenn jedoch die Reinheit ein Problem darstellt, müssen nachfolgende Reinigungsschritte befolgt werden.

Rohproteinextrakte werden durch Entfernung von durch Zelllyse erzeugten Zelltrümmern hergestellt, was unter Verwendung von Chemikalien und Enzymen , Beschallung oder einer French Press erreicht wird. Die Trümmer werden durch Zentrifugation entfernt, und der Überstand wird gewonnen. Rohpräparate von extrazellulären Proteinen können durch einfaches Entfernen der Zellen durch Zentrifugation erhalten werden.

Für bestimmte biotechnologische Anwendungen besteht ein Bedarf an thermostabilen Enzymen : Enzyme, die hohe Temperaturen ohne Denaturierung tolerieren können und dabei eine hohe spezifische Aktivität beibehalten. Organismen, die sie produzieren, werden manchmal als Extremophile bezeichnet. Ein einfacher Weg zur Reinigung eines hitzebeständigen Proteins besteht darin, die anderen Proteine ​​in der Mischung durch Erhitzen zu desaturieren, dann die Lösung abzukühlen (wodurch das thermostabile Enzym gegebenenfalls reformiert oder wieder aufgelöst wird). Die denaturierten Proteine ​​können dann durch Zentrifugation entfernt werden.

Zwischenreinigungsschritte

In der Vergangenheit war ein üblicher zweiter Schritt zur Reinigung eines Proteins aus einem Rohextrakt die Ausfällung in einer Lösung mit hoher osmotischer Stärke (dh Salzlösungen). Nukleinsäuren in dem Rohextrakt können durch Ausfällen von Aggregaten, die mit Streptomycinsulfat oder Protaminsulfat gebildet wurden, entfernt werden.

Die Proteinfällung wird üblicherweise unter Verwendung von Ammoniumsulfat als Salz durchgeführt.

Verschiedene Proteine ​​werden in verschiedenen Konzentrationen von Ammoniumsulfat ausfallen. Im allgemeinen fallen Proteine ​​mit höherem Molekulargewicht in geringeren Konzentrationen von Ammoniumsulfat aus. Salzausfällung führt normalerweise nicht zu einem hochgereinigten Protein, kann aber dazu beitragen, einige unerwünschte Proteine ​​in einer Mischung zu eliminieren und die Probe zu konzentrieren. Salze in der Lösung werden dann durch Dialyse durch poröse Celluloseschläuche, Filtration oder Gelausschlusschromatographie entfernt.

Moderne Biotech-Protokolle nutzen häufig die vielen im Handel erhältlichen Kits, die fertige Lösungen für Standardverfahren bereitstellen. Die Proteinreinigung wird oft unter Verwendung von Filtern und vorbereiteten Gelfiltrationssäulen durchgeführt. Alles, was Sie tun müssen, ist, den Anweisungen zu folgen und das richtige Volumen der richtigen Lösung hinzuzufügen und die spezifizierte Zeitdauer zu warten, während das Eluat (was am anderen Ende der Säule herauskommt) in einem frischen Reagenzglas gesammelt wird.

Quellen:

Zubay G. 1988. Biochemie, 2. Auflage. Macmillan Publishing Co., New York, NY, USA.

Amersham Pharmacia Biotech. 1999. Protein Purification Handbook, Ausgabe AB. Amersham Pharmacia Biotech Inc. New Jersey, USA. http://www.biochem.uiowa.edu/donelson/Database%20items/protein_purification_handbook.pdf.