Herausfinden, was für überlegene PCR-Ergebnisse erforderlich ist

Anpassungen an eine der Komponenten einer Polymerase-Kettenreaktion (PCR) können die Qualität des Ergebnisses verändern, entweder durch Verbesserung oder Verringerung der Produktausbeute und -qualität oder durch Verbesserung der Reaktionsspezifität und -empfindlichkeit. Parameter, die das Endergebnis beeinflussen, können entweder physikalisch (dh Temperatur, Zykluszeiten) oder chemisch (dh Template-Konzentration, Art des verwendeten Enzyms) sein. Die folgenden Schlüsselfaktoren beeinflussen den Erfolg der PCR.

  • 01 Saubere Laborbedingungen

    Pipetten © Phillips, 2008.

    Da PCR in der Lage ist, ein einzelnes DNA-Molekül nachzuweisen, ist es wichtig, im Labor einwandfreie Bedingungen aufrechtzuerhalten. Tragen Sie immer frische Handschuhe, verwenden Sie steriles Glas, Tuben und Pipettenspitzen und sterile Lösungen und reinigen Sie den Arbeitsbereich vor Arbeitsbeginn.

    Schließen Sie immer Kontrollreaktionen ohne Matrizen-DNA und ohne Enzym ein, um sicherzustellen, dass die Ergebnisse tatsächlich auf die Amplifikation der richtigen Probe zurückzuführen sind.

    Die meisten Menschen stellen sicher, dass sie ihre eigenen Lösungen haben, die nicht geteilt werden, um die Fehlersuche zu erleichtern, und bestimmte Pipetten werden oft nur für die PCR reserviert. DNase- und RNase-freie PCR-Röhrchen, aerosolbeständige Pipettenspitzen und Arbeiten im Abzug mit UV-Licht sind ebenfalls Möglichkeiten, Probleme zu minimieren.

  • 02 Chemische Komponenten

    Von kritischer Bedeutung ist auch die Reinheit und Integrität der Vorlage (gereinigte DNA) und des Primer-Designs. Es gibt mehrere Softwareprogramme, die online zum Entwerfen von Primern verfügbar sind. Die besten Primer:
    • Haben Sie 18 bis 24 Basen
    • Keine sekundäre Struktur haben (zB Haarnadelschleifen)
    • Ausgewogene Verteilung von G / C- und A / T-Paaren
    • Sind an den 3-Fuß-Enden nicht zueinander komplementär
    • Schmelztemperaturen (Tm) etwa 5-10 ° C unterhalb der Glühtemperatur, die üblicherweise zwischen 55 und 65 ° C liegt

    Die Tm für beide Primer sollte auch für beste Ergebnisse ähnlich sein.

  • 03 Reaktionsmischung: Schablone und Primer

    Die Anteile der Reaktionsmischung haben einen großen Einfluss auf die Qualität der PCR-Ergebnisse. Es gibt eine allgemeine Formel für Konzentrationen von Matrizen, Enzymen, Primern und Nukleotiden, die verwendet werden können, aber dies kann ein wenig optimiert werden.

    Optimale Primerkonzentrationen liegen zwischen 0,1 und 0,6 Mikromol / L. Die Menge an Matrize variiert in Abhängigkeit von der Art der DNA (Mensch, Bakterium, Plasmid).

    Bei sehr geringen Mengen an Matrizen gibt es andere Strategien, um Ergebnisse zu verbessern, wie erhöhte Zykluszahlen oder die Verwendung von "Heißstart". Testen Sie immer neue Primer mit einer positiven Kontrollreaktion, um sicher zu gehen, dass sie unter Ihren spezifischen experimentellen Bedingungen funktionieren.

  • 04 Reaktionsansatz: Enzymaktivität

    Die Wahl der DNA-Polymerase beeinflusst die Genauigkeit der Reaktion und die Qualität des Produkts. Die traditionelle Taq-Polymerase wurde in vielen Labors durch Enzyme mit höherer Wiedergabetreue ersetzt (diejenigen, die weniger Fehler machen).

    Die Konzentration von MgCl2 im Reaktionsgemisch kann das PCR-Ergebnis beeinflussen und könnte eine wichtige Rolle bei anspruchsvolleren Reaktionen spielen. Magnesiumkationen bilden lösliche Komplexe mit dNTPs, um das eigentliche Substrat zu erzeugen, das das Polymerase-Enzym erkennt.

    Gleiche Mengen aller vier dNTPs tragen auch dazu bei, die Polymerase-Fehlerrate zu reduzieren. Bestimmte Zusatzstoffe wie Betain, BSA, Detergentien, DMSO, Glycerin und Pyrophosphatase können ebenfalls die Enzymspezifität oder Reaktionseffizienz beeinflussen.

  • 05 Art des Thermocyclers

    Thermocycler © Phillips, 2008.

    Achten Sie beim Einkauf von Laborgeräten darauf, dass einige Thermocycler bei der Einhaltung der gewünschten Temperaturen weniger präzise als andere Thermocycler sind.

    Dies ist ein Bereich, in dem es sich auf lange Sicht nicht lohnen wird, billig zu sein, wenn Sie mit einer kniffligen Reaktion konfrontiert werden oder Primer verwenden, die einen engen Bereich der Glühtemperatur erfordern.

    Dünnwandige Reaktionsgefäße, die speziell auf die von Ihnen verwendete Thermocycler-Marke abgestimmt sind, tragen ebenfalls zur Optimierung der Reaktionstemperaturen bei.

  • 06 Zykluseinstellungen

    Reaktionszykluslängen, Temperaturen und eine Anzahl von Zyklen spielen eine entscheidende Rolle bei der Bestimmung, wie gut eine PCR funktionieren wird. Der anfängliche Erhitzungsschritt muss lang genug sein, um das Templat vollständig zu denaturieren, und die Zyklen müssen lang genug sein, um zu verhindern, dass sich die geschmolzene DNA an sich selbst anlagert.

    Eine erhöhte Ausbeute kann erreicht werden, indem die Verlängerungszeit etwa alle 20 Zyklen erhöht wird, um weniger Enzym zu kompensieren, um mehr Matrize zu amplifizieren. Üblicherweise genügen weniger als 40 Zyklen, um weniger als 10 Templatmoleküle zu einer Konzentration zu amplifizieren, die groß genug ist, um auf einem mit Ethidiumbromid gefärbten Agarosegel sichtbar zu sein .